靶向蛋白降解

人类参与生物(wù)學(xué)功能(néng)的蛋白大约有(yǒu)30,000多(duō)种，然而可(kě)成药的靶点只占据其中(zhōng)很(hěn)少的一部分(fēn)。探索不可(kě)成药靶点作(zuò)為(wèi)药物(wù)研发领域一个非常有(yǒu)挑战性但值得尝试的课题，因此备受关注。新(xīn)兴技(jì )术例如靶向蛋白降解技(jì )术，将為(wèi)该领域的发展提供极大助力。

蛋白靶向降解技(jì )术借助蛋白酶體(tǐ)和溶酶體(tǐ)这两大天然存在于人體(tǐ)内的细胞器对致病蛋白进行精(jīng)准降解，目前主流的蛋白降解通路大致分(fēn)為(wèi)三类：基于泛素-蛋白酶體(tǐ)系统、基于内體(tǐ)-溶酶體(tǐ)通路和基于自噬-溶酶體(tǐ)通路。蛋白降解通过细胞自身的蛋白酶系统来降解靶点蛋白(POI)，从而调控蛋白水平，而非像传统药物(wù)那样通过抑制靶点蛋白的功能(néng)来发挥其药物(wù)作(zuò)用(yòng)。

為(wèi)加速蛋白降解分(fēn)子发现的过程，ICE团队针对PROTAC的特性和发挥作(zuò)用(yòng)的环节，积极布局对应的研发能(néng)力，专注于难成药靶点的药物(wù)研发，如：蛋白水平开展蛋白表达和纯化、生物(wù)物(wù)理(lǐ)學(xué)评价，蛋白亲和力、三元复合物(wù)的形成等；细胞水平可(kě)优化蛋白的降解与表达水平的检测，比如传统WB、数字化WB、通量化ICW和IFA、HiBiT敲入稳转细胞系的构建等技(jì )术，也可(kě)以利用(yòng)商(shāng)品化试剂盒如AlphaLISA，ELISA, HTRF等方法检测总蛋白的表达水平；同时结合细胞信号转导通路的检测、细胞活力与增殖等层次，多(duō)方位确定PROTAC分(fēn)子在细胞中(zhōng)的活性；机制研究上可(kě)以通过ADME的方法、蛋白组學(xué)、结构生物(wù)學(xué)等手段，评价PROTAC分(fēn)子在细胞内发挥作(zuò)用(yòng)的机制，也可(kě)以通过抑制剂的手段研究蛋白降解通路的特异性等等，形成了完整的蛋白靶向降解剂筛选平台。

以BTK的PROTAC為(wèi)例，简要地描述ICE在PROTAC分(fēn)子早期研发布局的常用(yòng)分(fēn)析方法。

传统電(diàn)泳Western Blot实验（ICE数据）

相比传统電(diàn)泳Western Blot实验而言，JESS则显得更為(wèi)便捷，制备样本流程简单，

目前ICE团队已用(yòng)JESS顺利完成多(duō)项蛋白降解相关实验。

数字化Western Blot-JESS实验（ICE数据）

对于大量的PROTAC分(fēn)子细胞活性筛选，也有(yǒu)适合于微孔板的方式，如可(kě)开发方法的In-cell western（ICW）和Immunofluorescence assay（IFA），ELISA、Alphalisa等技(jì )术。

ICW assay（ICE数据）

IFA assay（ICE数据）

对于通量的筛选，也可(kě)使用(yòng)HiBiT内源敲入的细胞系，快速筛选可(kě)降解BTK蛋白的PROTAC分(fēn)子，同时还可(kě)以看到降解的一些动力學(xué)过程，也可(kě)一并看到PROTAC分(fēn)子对细胞增殖过程的影响。

HiBiT内源敲入的细胞系（ICE数据）

PROTAC具(jù)有(yǒu)分(fēn)子量较大、氢键较多(duō)、溶解性较差、透膜性较差、稳定性较差等特性，需要尽早收集ADME相关数据，比如PROTAC分(fēn)子在溶液中(zhōng)的溶解度、LogD，LogP，在血浆、肠液、胃液、原代肝细胞、筛选细胞实验培养基中(zhōng)的稳定性等等，透膜性也是另一个重要的参数，比如测试Caco-2，MDCKII, MDCKII-MDR1等细胞系中(zhōng)的Papp，做细胞实验所需细胞系中(zhōng)的透膜能(néng)力等等；还有(yǒu)代謝(xiè)稳定性，在肝微粒體(tǐ)和原代肝细胞中(zhōng)的稳定性等等。结合體(tǐ)外的筛选平台，也可(kě)以通过靶点结合和生物(wù)标记物(wù)分(fēn)子的检测，快速评价PROTAC透过肿瘤细胞的能(néng)力及与靶点的结合能(néng)力。对于脱靶效应的检测，也是非常重要，这个也受限于PROTAC的基本原理(lǐ)，当分(fēn)子与非靶点蛋白有(yǒu)较弱或中(zhōng)等的亲和力时，也有(yǒu)可(kě)能(néng)带来脱靶降解，常会用(yòng)到蛋白组學(xué)的方法来分(fēn)析。

液质(zhì)联用(yòng)（LC-MS/MS）可(kě)以快速结合细胞學(xué)化合物(wù)处理(lǐ)的条件，简单便捷分(fēn)析一些参数，比如细胞对化合物(wù)的摄取量、非特异结合的量、生物(wù)转化的量、化合物(wù)溶解性及稳定性等等，这些分(fēn)析简单的构成了细胞生物(wù)利用(yòng)度，可(kě)以从一定程度上解释化合物(wù)在酶學(xué)和细胞學(xué)实验體(tǐ)系中(zhōng)活性的相对差异。爱思益普目前已经可(kě)以提供此类试验分(fēn)析，可(kě)及时便捷地為(wèi)大家提供troubleshooting的试验数据。

目前新(xīn)的蛋白降解方式不断出现，如分(fēn)子胶，LYTACs，AUTACs，ATTECs，RIBOTACs，等等。对于膜蛋白而言，ICE有(yǒu)着丰富的稳转细胞系储备，如离子通道、GPCR受體(tǐ)等，希望在膜蛋白的降解领域能(néng)给大家更多(duō)的支持，為(wèi)中(zhōng)國(guó)蛋白降解领域的药物(wù)研发做一些事。