双電(diàn)极膜片钳

近年来,随着分(fēn)子生物(wù)學(xué)和電(diàn)生理(lǐ)技(jì )术的发展,卵母细胞表达系统成為(wèi)研究转运體(tǐ)和离子通道的重要手段。大量的实验采用(yòng)卵母细胞表达系统研究离子通道与受體(tǐ)的功能(néng)和结构。双電(diàn)极電(diàn)压钳技(jì )术是卵母细胞電(diàn)生理(lǐ)研究的基本方法。

双電(diàn)极電(diàn)压钳(Two Electrode Voltage Clamp)系统是一套运用(yòng)于巨大细胞(例如乌贼轴突、爪蟾卵母细胞等)的双電(diàn)极全细胞電(diàn)压钳记录设备,主要用(yòng)于受體(tǐ)和离子通道的研究。

双電(diàn)极電(diàn)压钳主要应用(yòng)的是電(diàn)压钳技(jì )术。電(diàn)压钳技(jì )术( voltage clamp )是由 Cole 和 Marmont 设计的,后经英國(guó)剑桥大學(xué)的 Hodgkin 和 Huxley 成功 改进。電(diàn)压钳技(jì )术的原理(lǐ)是通过一个反馈電(diàn)路向细胞膜内注入電(diàn)流,使膜電(diàn)位始终与指令電(diàn)位保持一致,如此 , 便可(kě)在膜電(diàn)位被钳制于任何一个给定水平的状态下记录膜電(diàn)流的变化。 Hodgkin 和 Huxley 在枪乌贼巨大神经轴突上测得了的离子流。于1963年与澳大利亚科(kē)學(xué)家 John Carew Eccles ( 1903~1997 ) 因研究神经脉冲、神经纤维传递而共同获得诺贝尔生理(lǐ)學(xué)或医(yī)學(xué)奖。

電(diàn)生理(lǐ)实验的目的在于通过细胞级层面的研究,了解离子通道或转运體(tǐ)的功能(néng)。目前,对这些研究的理(lǐ)解受表达模型系统的限制,很(hěn)难找到一个十分(fēn)适合的模型。大多(duō)数细胞都会同时表达多(duō)个不同通道的并相互影响。因此,单独研究某一种离子通道的特性是很(hěn)困难的。通常需要加入干扰通道的对应抑制剂或通过控制钳制電(diàn)压以达到所需的研究目的。但缺点是使细胞失去一些正常的生理(lǐ)活性。

爪蟾卵母细胞表达系统能(néng)较好的解决这一问题。该系统是由Gurdon在1971年提出,用(yòng)于研究基因表达控制的多(duō)种特性。可(kě)以将来自其他(tā)种属细胞的DNA或mRNA注射到细胞质(zhì)中(zhōng),待其表达后,便可(kě)开始实验研究。例如,将日本单鳍電(diàn)鳐的電(diàn)器官细胞中(zhōng)的mRNA注射到卵母细胞中(zhōng),可(kě)以表达功能(néng)性乙酰胆碱通道;而将大鼠脑细胞中(zhōng)的mRNA注射到卵母细胞中(zhōng),则可(kě)以表达多(duō)种電(diàn)压门控的钠离子或如NMDA受體(tǐ)GABA受體(tǐ)等的配體(tǐ)门控通道的表达;也可(kě)将拟南芥叶片细胞中(zhōng)的mRNA注射到卵母细胞中(zhōng),可(kě)以记录到電(diàn)压门控的钙离子通道等等。

卵母细胞表达系统主要有(yǒu)如下优点:

1. 一只成年爪蟾可(kě)以一次性获得上百个活性卵母细胞。这些细胞通过外科(kē)手术获得,不需处死爪蟾。一只爪蟾可(kě)以反复取卵多(duō)次。

2. 卵母细胞分(fēn)离后,不需要很(hěn)复杂的设备便可(kě)以实施培养。

3. 卵母细胞个头较大,肉眼可(kě)见,故而易于注射DNA和RNA。

4. 卵母细胞可(kě)以表达包括动植物(wù)在内不同种属的RNA。

5. 细胞自身具(jù)有(yǒu)的离子通道较少,主要為(wèi)钙离子激活的氯离子通道,对要研究的通道影响很(hěn)小(xiǎo)。

6. 成熟的细胞,體(tǐ)积巨大,动物(wù)极呈深棕色,两个半球之间有(yǒu)一条清晰的亮环赤道带,直径大约為(wèi)1200~1300μm,巨大的细胞核中(zhōng)含有(yǒu)大量的酶。单个卵母细胞每天可(kě)合成大约400ng的蛋白质(zhì),平均每小(xiǎo)时合成20ng的蛋白质(zhì),不过不合成DNA。外源性的mRNA和内源性的mRNA互相竞争,约有(yǒu)高达50%的蛋白质(zhì)可(kě)直接由外源性的mRNA翻译合成,平均每小(xiǎo)时合成10ng蛋白质(zhì),因此可(kě)以说其是非常理(lǐ)想的表达外源基因的體(tǐ)系。

随着分(fēn)子生物(wù)學(xué)和電(diàn)生理(lǐ)技(jì )术的发展,卵母细胞表达系统在探究一些单细胞上不易表达记录的通道(如乙酰胆碱受體(tǐ)等配體(tǐ)门控通道)有(yǒu)着卓越的贡献。

肌肉型乙酰胆碱激动作(zuò)用(yòng)EC50

 

 

 

肌肉型乙酰胆碱受Adiphenine抑制作(zuò)用(yòng)IC50

 

 

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